書籍介紹
即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time quantitative polymerase chain reaction, real-time qPCR) 為具高特異性且可快速、大量定量的分析方法，為目前退伍軍人菌檢測主要之發展方向。冷卻水塔為退伍軍人菌重要滋生源，但水塔中累積許多有機物與鐵銹，這些均可能抑制real-time qPCR反應，若未能去除抑制物干擾，則可能低估real-time qPCR檢測結果。本研究比較QiAamp DNA mini kit (Q) 與freeze-thaw/phenol-chloroform (FT-PC) 兩種DNA萃取方法，以及此兩種方法加上膠體管柱 (Sepharose 4B gel column, G) 純化對PCR抑制物的移除、分離的DNA純度及DNA產量之影響；另亦評估Q、Q/G、FT-PC及FT-PC/G結合稀釋作用後所得real-time qPCR抑制情形以及其相對應之L. pneumophila濃度。結果發現：(i) 對腐植酸與鐵離子共存樣本，以Q及FT-PC均可去除≦100 μg/mL腐植酸至低於偵測下限 (1 μg/mL)；(ii) 而不論鐵離子單獨或與腐植酸共存的樣本，Q均可得獲得最高DNA產量 (2.53~3.36; 6.58~6.79 μg/mL)，其次為FT-PC (2.00~2.37; 3.90~4.33 μg/mL)，Q/G (1.15~1.27; 3.21~3.33 μg/mL) 及FT-PC/G (0.76~0.80; 1.77~1.85 μg/mL)；(iii) 四種方法均可獲得純度佳的DNA (A260/A280=1.5-2.0)；(iv) 以G純化DNA無法進一步改善PCR抑制情形，而稀釋作用則可有效去除以Q、Q/G以及FT-PC/G所得DNA之PCR抑制情形。及 (v) 比較四種處理方法結合不同稀釋倍數於real-time qPCR檢測L. pneumophila濃度之結果發現：只含鐵離子的樣本以Q萃取加上10倍或100倍的稀釋可得最接近起使添加之細菌濃度值；而鐵離子與腐植酸共存之樣本，最佳之處理程序則為Q或Q/G分離DNA再加上10倍或100倍的稀釋。由於Q/G程序較複雜且會造成部分DNA損失，因此本研究建議以Q萃取法加上10倍或100倍稀釋為以real-time qPCR檢測含有鐵離子單獨或與腐植酸共存水樣中L. pneumophila之最佳DNA處理程序。
目次
摘 要iAbstractii目錄iii圖目錄v表目錄vi第一章 計畫概述1第一節 前言1第二節 目的1第三節 工作項目1第二章 文獻回顧2第一節 退伍軍人菌特性2第二節 退伍軍人菌檢測方法2第三節 環境中的PCR抑制物3第四節 PCR抑制物移除方法3第三章 材料與方法5第一節 研究設計5第二節 實驗步驟5第三節 實驗菌種培養與濃度調控6第四節 血球計數器計數退伍軍人菌方法建立7第五節 含抑制物樣本製備7第六節 DNA萃取純化7第七節 腐植酸定量10第八節 DNA純度 (DNA purity)10第九節 DNA產量10第十節 Real-time qPCR分析10第四章 結果13第一節 血球計數器計數L. pneumophila方法建立13第二節 Sepharose 4B gel column填充條件最佳化14第三節 DNA萃取純化方法評估15第五章 討論30第六章 結論32致謝33參考文獻34圖目錄圖 1 實驗流程圖6圖 2 SEPHAROSE 4B GEL COLUMN裝置示意圖9圖 3 不同濃度L. PNEUMOPHILA吸光度值與血球計數器及培養法量測濃度之相關性 (N=3)13圖 4 血球計數器與培養法定量L. PNEUMOPHILA之相關性 (N=3)14圖 5 不同SEPHAROSE 4B GEL COLUMN填充程序之DNA回收濃度 (N=3)。P表示填充 (PACKING)，W則為HIGH SALTED TE BUFFER清洗 (WASHING)，數字則為次數。所有填充程序彼此間僅填充方式不同，但SEPHAROSE 4B GEL COLUMN及DNA純化方法均相同。15圖 6 不同DNA處理程序於不同鐵離子濃度、稀釋倍數下對REAL-TIME QPCR抑制之影響19圖 7 REAL-TIME QPCR檢測分離自含有FE3+樣本之DNA的稀釋效應20圖 8 不同DNA處理程序於不同鐵離子、腐植酸濃度、稀釋倍數下對REAL-TIME QPCR抑制之影響26圖 9 REAL-TIME QPCR檢測分離自含HA+FE3+樣本之DNA的稀釋效應27表目錄表 1 本研究中使用之四種DNA分離方法5表 2 SEPHAROSE 4B GEL COLUMN填充程序9表 3 兩種萃取純化組合處理含鐵離子樣本於各階段所得之L. PNEUMOPHILA 之DNA產量及純度評估17表 4 含鐵離子樣本經不同DNA處理程序可測得之L. PNEUMOPHILA 濃度22表 5 兩種萃取純化方法於萃取及純化階段對腐植酸移除情形23表 6 兩種萃取純化組合處理含鐵離子與腐植酸樣本於各階段所得之L. PNEUMOPHILA 之DNA產量及純度24表 7 含腐植酸與鐵離子樣本經不同DNA處理程序可測得之L. PNEUMOPHILA 濃度29
分類
其他詳細資訊
- 英文題名：Effects of PCR inhibitors on quantification of Legionella pneumophila
- 出版品網址（線上版或試閱版)：連結
- 適用對象：成人(學術性)
- 關鍵詞：退伍軍人菌、DNA萃取純化方法、real-time qPCR抑制
- 附件：無附件
- 頁/張/片數：36
授權資訊
- 著作財產權管理機關或擁有者：行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所
- 取得授權資訊：聯絡人：聯絡電話：聯絡地址：行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所221台北縣汐止市橫科路407巷99號電話：02-26607600 何俊傑