書籍介紹
退伍軍人菌在自然界中分佈甚廣，其中作業場所使用之冷卻水塔，其水體及生物膜更是常檢出退伍軍人菌的環境。人體感染退伍軍人菌後會引起退伍軍人症與龐克提亞克熱，故定期監測水體及生物膜中退伍軍人菌為預防職業性感染之重要課題。
即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time quantitative polymerase chain reaction, real-time qPCR) 為具高特異性且可快速定量的分析方法，為目前退伍軍人菌檢測的主要發展方向。但若未能有效去除環境樣本中的qPCR抑制物，則易低估退伍軍人菌的實際濃度。過去研究主要探討水中qPCR抑制物對定量退伍軍人菌的影響，缺少生物膜抑制物的研究，且未將qPCR抑制物的監測結果應用於修正檢測方法。為使已開發的PCR定量法能夠有更廣泛的環境應用面，故在已建立的PCR監測水樣技術上，進一步開發以real-time qPCR監測生物膜中退伍軍人菌之方法，輔以抑制內標法(Internal Inhibition Control, IIC) 建立監測樣本中qPCR抑制之技術，並以環境樣本進行驗證。
結果顯示，超音波震盪(sonication)與vortex對於生物膜中退伍軍人菌之定量均具有良好回收率，分別為85-93%以及93-95%，但冷卻水塔生物膜樣本則以vortex可獲得較高之Legionella spp.與L. pneumophila濃度，且其偵測下限為50 cells/sample。IIC以neomycin phosphotransferase gene進行設計，所得序列全長為209 bp；進行IIC與Legionella的multiplex PCR反應時，25 fg/PCR及250 fg/PCR的IIC添加量均不影響Legionella定量，亦不受Legionella DNA濃度的影響，故以25 fg/PCR IIC應用於Legionella 之qPCR抑制監測：實驗室配製含8 μg/L與10 μg/L腐植酸 (humic acid, HA)及1 mM與2.6 mM鐵離子之Legionella樣本，IIC測得之qPCR抑制程度與以qPCR定量Legionella之低估情形相似；而添加0.1 mM鐵離子之樣本則未測得qPCR抑制，亦未觀察到Legionella低估的情形，顯示IIC可確實反映造成Legionella低估的qPCR抑制情形。而環境樣本的評估則顯示大部分的樣本以100 倍稀釋具最低之qPCR抑制情形；另外，冷卻水塔的樣本除了懸浮態生物膜（Floating Biofilm, FB）中的L. pneumophila檢測需10倍稀釋外，其餘樣本均以100倍稀釋可檢出最高L. pneumophila濃度；Legionella spp.則均以100倍稀釋可測得最高濃度。而熱水系統則以10倍稀釋與未稀釋樣本分別可得最高之Legionella spp.與L. pneumophila濃度。綜合qPCR抑制情形與測得之Legionella濃度，建議在以PCR定量L. pneumophila時，冷卻水塔FB樣本之DNA需進行10倍稀釋，而其他類型樣本則需稀釋100倍；Legionella spp.則以100倍稀釋DNA進行定量。至於熱水系統各類型樣本DNA，建議以10倍稀釋及未稀釋之DNA樣本進行Legionella spp.與L. pneumophila的定量。經此處理後，對於有明顯qPCR抑制之樣本，再視檢出之Legionella濃度與qPCR抑制程度適度調整稀釋倍數，可避免低估Legionella與L. pneumophila的濃度。
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- 適用對象：成人(學術性)
- 關鍵詞：退伍軍人菌、生物膜、Real-time qPCR抑制、抑制內標
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